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血液中乙醇的测定 顶空气相色谱法

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血液中乙醇的测定
顶空气相色谱法
1 范围
本技术规范规定了血液中乙醇的顶空气相色谱测定方法。
本技术规范适用于血液中乙醇的定性及定量分析。
本技术规范的方法检出限为0.01mg/mL;定量下限为0.05mg/mL。
2 规范性引用文件
下列文件对于本技术规范的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本技术规范。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本技术规范。
GB/T 6682  分析实验室用水规格和试验方法(GB/T 6682-2008,ISO 3696:1987,MOD)
GA/T 122  毒物分析名词术语
3 原理
本法利用乙醇的易挥发性,以叔丁醇为内标,用顶空气相色谱火焰离子化检测器进行检测,经与平行操作的乙醇对照品比较,以保留时间进行定性分析;以峰面积为依据,用内标法定量。
4 试剂和材料
除另有说明外,水为GB/T 6682规定的二级水。
4.1 乙醇
色谱纯。
4.2 乙醇标准溶液
精密称取适量乙醇,用水配成10.0mg/mL乙醇标准储备溶液。储备液在冰箱中冷藏密闭保存,有效期为6个月。试验中所用其它浓度的标准溶液均从上述储备液稀释而得,在冰箱中冷藏密闭保存,有效期为3个月。
4.3 叔丁醇
色谱纯。
4.4 叔丁醇溶液
精密称取适量叔丁醇,用水配成5.0mg/mL叔丁醇储备液。储备液在冰箱中冷藏密闭保存,有效期为12个月。将储备液用水稀释,得40.0μg/mL叔丁醇内标工作液,在冰箱中冷藏密闭保存,有效期为6个月。
5 仪器 
5.1 气相色谱仪
配火焰离子化检测器(FID)。
5.2 顶空进样器
配1mL定量进样环。
5.3 样品瓶
10mL,顶空自动进样器用。
5.4 硅橡胶垫
5.5 铝帽
5.6 密封钳
5.7 精密移液器
5.8 自动稀释仪
6 测定步骤
6.1 样品处理
用精密移液器或自动稀释仪取待测血液0.10 mL及0.50 mL 40.0μg/mL 叔丁醇内标工作液,加入样品瓶内,盖上硅橡胶垫,用密封钳加封铝帽,混匀。
6.2 测定
6.2.1 顶空气相色谱测定参考条件
a) 色谱柱(1):DB-ALC1(30m0.32mm1.8m)石英毛细管柱或相当者;
柱温:恒温40C; 
色谱柱(2):DB-ALC2(30m0.32mm1.2m)石英毛细管柱或相当者;
柱温:恒温40C;
b) 载气:氮气,纯度≥99.999%,流速8mL/min;
c) 进样口温度:150C;
d) 检测器温度:250C;
e) 加热箱温度:65C;
f) 定量环温度:105C;
g) 传输线温度:110C;
h) 气相循环时间:3.5min;
i) 样品瓶加热平衡时间:10.0min;
j) 样品瓶加压时间:0.10min;
k) 定量环充满时间:0.10min;
l) 定量环平衡时间:0.05min;
m) 进样时间:1.00min。
6.2.2 定性测定
样品溶液按照顶空气相色谱测定条件测定,以叔丁醇为内标,记录色谱峰的保留时间。将待测样品色谱峰的保留时间与乙醇标准对照品的保留时间比较,相对误差在2%内,空白对照样品内标物色谱峰正常而无乙醇的色谱峰,一般可以认为待测样品中含有乙醇;必要时,选择不同的色谱条件或用气相色谱-质谱法确证。如果内标物色谱峰正常,而无乙醇的色谱峰时,可认为检验结果为阴性。乙醇对照品和内标气相色谱图,参见附录A。
6.2.3 定量测定
本方法采用内标法-校准曲线法或内标法-单点校正法定量测定。
6.2.3.1  内标法-校准曲线法
采用内标-校准曲线法测定(见附录B)。将乙醇对照品溶液进样,以乙醇和内标峰面积比为纵坐标,乙醇对照品工作溶液浓度为横坐标绘制标准曲线,用标准曲线对待测样品进行定量,所测样品中乙醇的浓度值应在线性范围内。
6.2.3.2  内标法-单点校正法
待测血液样品乙醇浓度在标准溶液浓度的±30%内可用单点法定量。
6.3 平行试验
按以上步骤对同一待测样品进行平行试验。
单柱单检测器两份样品测定结果按两份样品的平均值计算,双样相对相差不得超过10%(有凝血块的血样不超过15%)。双样相对相差按式(1)计算:
                                    | C1 - C2|
双样相对相差(%) =   100     ………………………………(1)
                                      C

式中:
C1、C2两份样品平行定量测定的结果;
C 两份样品平行定量测定结果的平均值(C1+C2)/2。
双柱双检测器两份样品测定结果的相对标准偏差RSD(%)若不超过5%时(有凝血块的血样不超过10%),结果按两份样品结果的平均值计算。
7 结果计算
血液中乙醇浓度测定采用内标法-校准曲线法定量或按式(2)计算:
                                 A Ai′c          
                   C =          …………………………………(2)
                                  A′Ai             

式中:
C血液样品中乙醇浓度,单位为毫克每毫升(mg/mL);
A血液样品中乙醇的峰面积;
A′标准溶液中乙醇的峰面积;
Ai′标准溶液中内标物的峰面积;
Ai血液样品中内标物的峰面积;
c标准溶液中乙醇浓度,单位为毫克每毫升(mg/mL)。



附 录 A
(资料性附录)
乙醇对照品和内标气相色谱图
A.1 按色谱柱(1)条件得乙醇对照品和内标气相色谱图,见图A.1。
 
图A.1 按色谱柱(1)条件得的乙醇对照品和内标气相色谱图

A.2 按色谱柱(2)条件得乙醇对照品和内标气相色谱图,见图A.2。
 
图A.2 按色谱柱(2)条件得的乙醇对照品和内标气相色谱图





 
附 录 B
(资料性附录)
校准曲线
配制乙醇浓度为0.10、0.20、0.50、0.80、1.00、2.00、3.00mg/mL的水溶液,按6.1和6.2项下分析,每一浓度点取2份,以乙醇与内标叔丁醇的峰面积比对乙醇浓度做标准曲线。
  按色谱柱(1)条件测得的标准曲线方程为 X = 1.0761 C - 0.0162(r = 0.9997),按色谱柱(2)条件测得的标准曲线方程为 X = 1.0655 C - 0.0177(r = 0.9997)。式中X为乙醇与叔丁醇的峰面积比值,C为乙醇工作溶液浓度(mg/mL)。